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大肠杆菌(E. coli)的类型和在生物技术中的用途

大肠杆菌是一种革兰氏阴性杆状细菌,主要存在于人和动物的小肠下部。它是一种兼性厌氧菌,这意味着它可以在有氧的情况下产生能量 (ATP),并在厌氧条件下转为发酵。

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大肠杆菌的类型

大肠杆菌有两种主要类型,共生(非致病性)和致病性大肠杆菌

共生(非致病性)大肠杆菌

大肠杆菌的共生菌株是正常肠道微生物群的一部分。它们可用于消化和控制肠道中其他病原菌的生长。它们还制造维生素 B2(核黄素)和维生素 K2(甲基萘醌)。实验室常用的一些非致病性大肠杆菌菌株有大肠杆菌K-12、大肠杆菌BL-21、大肠杆菌B。

致病性大肠杆菌

致病性大肠杆菌进一步分为两类,肠道致病性大肠杆菌和肠外致病性大肠杆菌。

肠道致病(肠道病原体)大肠杆菌

肠道致病性大肠杆菌有 7 种类型,它们都会引起人类腹泻样症状。它们可以通过受污染的食物和水传播。

肠致病性大肠杆菌 (EPEC)

食物或水中的粪便物质会导致 EPEC 的传播。它会引起水样腹泻、粘液、发烧和呕吐等症状。

肠出血性大肠杆菌(EHEC)

这种致病性大肠杆菌可导致人类患上溶血性尿毒症综合征 (HUS) 等严重疾病。它们会产生一种名为“志贺”的毒素,会损害肠道和肾脏的内壁。症状可能包括血性腹泻、呕吐和腹部绞痛。

肠侵袭性大肠杆菌 (EIEC)

它侵入肠壁并引起高烧腹泻等症状。它们具有高度侵入性并损害肠壁,但它们不会产生任何毒素。

肠毒素大肠杆菌 (ETEC)

它产生的毒素会破坏肠壁并导致旅行者腹泻。它产生两种毒素,ST(耐热毒素)和 LT(耐热毒素)。

肠聚集性大肠杆菌 (EAEC)

这种致病性大肠杆菌可引起发展中国家儿童的急性和慢性腹泻。它们产生可以破坏肠壁的毒素。EAEC 产生的 3 种主要毒素是质粒编码毒素 (Pet)、热稳定毒素和志贺氏菌肠毒素 1 (ShEt1)。

扩散粘附的大肠杆菌 (DAEC)

可引起儿童急性腹泻。它们通过其扩散的粘附模式来识别,其中细菌几乎覆盖整个上皮细胞。

粘附侵入性大肠杆菌 (AIEC)

它与克罗恩病有关。这种致病性大肠杆菌可以通过 Fim H 和细胞粘附分子 6 粘附在肠上皮细胞上。

肠外致病性大肠杆菌

它们会引起严重的感染,如尿路感染、败血症、肺炎和新生儿脑膜炎。它们主要有四种类型。

新生儿脑膜炎大肠杆菌 (NMEC)

它会导致新生儿脑膜炎。NMEC可以避开宿主防御机制进入血脑屏障。

脓毒症相关大肠杆菌 (SPEC)

这种大肠杆菌菌株会导致血液中的严重感染(败血症),在严重的情况下,它会导致死亡。出现了许多耐抗生素的 SPEC 菌株,尤其是耐多药菌株。

泌尿致病性大肠杆菌 (UPEC)

这种大肠杆菌菌株是导致人类 UTI(尿路感染)的原因。它们的表面有菌毛、菌毛和鞭毛,这有助于它们粘附到上皮细胞上。

禽致病性大肠杆菌(APEC)

这种大肠杆菌菌株可引起鸡和其他鸟类物种的多发性浆膜炎、败血症等疾病。研究表明,肺和气囊之间的空间是APEC进入血液的重要部位,导致败血症。造成 APEC 毒力的因素是表面存在粘连(菌毛、菌毛)、对杀菌剂的抗性。

大肠杆菌的特性使其成为实验室分子克隆和蛋白质表达的完美模型

  • 大肠杆菌在 37.4C 左右的温暖温度下生长,在实验室中易于维护。

  • 它是一种简单的原核生物,具有众所周知的遗传学,有助于在大肠杆菌中轻松进行基因操作。

  • 它具有最低和简单的营养需求。它的生长需要富含碳、氮和磷的饮食。

  • 作为兼性厌氧菌,它在有氧和无氧条件下都可以很容易地生长,因此很容易在培养瓶中生长。

  • 大肠杆菌的倍增时间为20分钟。它生长得很快,这有助于蛋白质的快速表达。

  • 大肠杆菌中质粒的存在使其成为分子克隆和蛋白质表达的重要工具。质粒是几乎所有细菌细胞(如大肠杆菌)中都存在的小的双链 DNA 分子。该质粒含有抗生素抗性基因,可作为基因克隆的选择性标记。它们与细菌 DNA 物理分离,并且可以独立于细菌 DNA 进行复制。这些质粒可以作为载体(或载体)将我们感兴趣的外源 DNA 引入宿主细菌细胞。

在分子克隆中使用大肠杆菌

克隆是一种方法,其中通过将感兴趣的基因插入合适的载体(主要是质粒)中来产生基因的多个拷贝。然后通过称为转化的过程将修饰的载体插入感受态宿主细胞。最常用于克隆的大肠杆菌菌株是 XL-1 blue 和 DH5α。随着细菌宿主细胞的分裂,感兴趣的基因也随之分裂,产生多个外来插入基因的拷贝。分子克隆可用于为 DNA 测序、诱变、蛋白质表达、基因分型等实验创建多个基因拷贝。

什么是向量?

载体是一小段 DNA 分子,可以在宿主生物体(如大肠杆菌)中维持并轻松复制。载体用于在核酸内切酶的帮助下插入感兴趣的外源 DNA(或基因)。载体应具有多个克隆位点 (MCS),以便轻松插入外源 DNA 片段。MCS 是具有许多限制性内切酶位点的短 DNA 序列。克隆载体的一些例子是质粒、粘粒、BAC(细菌人工染色体)、噬菌体等。

什么是限制性内切酶?

这些酶通过破坏多核苷酸链内的磷酸二酯键将 DNA 切割成两个片段。他们在特定的核苷酸序列(又称限制性位点)处切割 DNA。这些酶的作用导致 DNA 片段具有粘性或平端。限制性内切酶的一些例子是 EcoRI、BamHI 和 Hind III。

制药公司在重组蛋白生产 (RPP) 中使用大肠杆菌

重组蛋白由重组 DNA 编码,通过基因工程对其进行操作以大量生产所需的蛋白质。重组蛋白用于生产胰岛素、酶、重组激素、溶栓药物等药物产品。这种制造重组蛋白的过程称为重组DNA技术。大肠杆菌已在商业上用作生产您选择的重组蛋白的工厂。由于较少的世代时间和大量分裂的能力,大肠杆菌已被用作用于治疗用途的非糖基化蛋白质生产的合适宿主。E.coli BL-21 和 E.coli K 12 是商业上用于 RPP(重组蛋白生产)的两种菌株;然而,

什么是重组 DNA 技术?

众所周知,我们的身体需要蛋白质来实现各种功能,例如,消化食物所需的酶在自然界中就是蛋白质。我们知道DNA首先被转录成mRNA分子,然后再翻译成蛋白质。简而言之,要制造重组蛋白,首先必须形成 rDNA(重组 DNA)。重组 DNA 技术是将来自不同物种的 DNA 结合在一起,产生重组 DNA 的方法,否则通常不会在基因组中发现这种重组 DNA。

重组蛋白生产涉及的步骤

  • 在限制性内切酶的帮助下将感兴趣的基因引入表达载体。表达载体通常是专为在宿主细胞中表达基因而设计的质粒或病毒。表达载体必须具有复制起点、启动子结合位点、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子、抗生素抗性基因(选择标记)和多克隆位点 (MCS) 等特征,可以插入感兴趣的基因。

  • 然后将含有目的基因的表达载体转化到感受态宿主细胞(如大肠杆菌BL21)中。转化可以通过多种方法完成,如电穿孔、热休克处理等。

  • 一旦表达载体被转化到宿主细胞中,它不会开始翻译所需的蛋白质,直到我们诱导它。可以通过添加某些化学物质如 IPTG(异丙基 Bd-1 硫代吡喃半乳糖苷)来实现诱导。它触发重组 DNA 的转录,从而触发所需重组蛋白的翻译。

  • 如此形成的重组蛋白质可以通过蛋白质纯化方法分离。它是从细胞、组织等的复杂混合物中分离 RPP 的过程。


克隆载体和表达载体的区别

克隆载体用于将 DNA 片段携带到宿主细胞中并复制它。表达载体用于将重组 DNA 表达成蛋白质。

大肠杆菌在生物技术中的作用

如果你是生物系的学生,你一定听说过大肠杆菌;它已被用于许多生物技术过程,如分子克隆、蛋白质表达、DNA 储存、生物燃料生产等。它在 DNA 复制、操纵子系统、遗传密码和转基因等许多获奖发现中发挥了关键作用生物。

在疫苗生产中

我们都知道,接种疫苗是控制传染病传播的最有效方法。借助科学新技术,我们可以通过疫苗接种保护自己免受许多传染病的侵害。已经使用大肠杆菌作为宿主产生了许多疫苗,例如基于病毒样颗粒 (VLP) 的疫苗。VLP 疫苗能够在人类中诱导先天性和适应性免疫反应。这些疫苗含有病毒结构蛋白,但不含病毒遗传物质。大肠杆菌已被用作这些病毒样颗粒疫苗的宿主。第一种源自大肠杆菌的病毒疫苗是 Hecolin,它是一种基于重组 VLP 的针对戊型肝炎病毒的疫苗。

在生物修复

生物修复是通过刺激微生物的生长来处理环境污染物的过程,微生物可以分解有毒污染物并将其转化为无毒化合物。灭多威是一种用于杀虫剂的有毒化学物质。在一项研究中观察到,在含有灭多威的培养基中培养大肠杆菌会显着导致其降解。后来通过许多研究证实,质粒和大肠杆菌中的基因是造成灭多威降解的原因。

在生物燃料生产中

石油成本的增加和自然资源的枯竭促使研究人员探索新的可再生燃料资源。乙醇、沼气和生物柴油等生物燃料是由微生物活动产生的。使用微生物作为生物燃料合成的潜在候选者取决于它们以更快的速度和最低的成本生产生物燃料的能力。大肠杆菌因其基因调控和生长代谢得到充分研究而被用作潜在的生物燃料发生器。在需氧和厌氧条件下,大肠杆菌都可以利用碳源生产生物燃料。基因工程和合成生物学使得产生新的生物合成途径并将这些途径整合到大肠杆菌中以优化生物燃料的生产成为可能。

大肠杆菌基因工程以更好地生产乙醇

生物乙醇是商业上使用最多的生物燃料之一,主要由低纤维素(木质素、半纤维素和纤维素)生产。半纤维素水解后释放的己糖被某些酵母和细菌通过发酵转化为乙醇。酿酒酵母然而,它不能将戊糖发酵成乙醇。在这种情况下,大肠杆菌可以用作生物燃料生产商,因为它可以在厌氧条件下发酵戊糖和己糖。大肠杆菌通过在厌氧条件下将1个葡萄糖分子代谢成2分子甲酸、2分子乙酸和1分子乙醇的途径产生乙醇。Ingram 等人通过插入来自运动发酵单胞菌的 2 个基因 pdc 和 adhB 对大肠杆菌的这种内源性途径进行了一些改变,以大量生产乙醇。将这 2 个基因引入大肠杆菌中,乙醇产量提高了 95%。

用于存储 DNA 序列

大肠杆菌可用于存储来自其他生物体(如人类)的 DNA 序列。含有其他生物体 DNA 序列的大肠杆菌可以在低温冰箱中保存很长时间。研究人员可以通过在 37°C(肠道温度)下解冻大肠杆菌细胞,然后用内切核酸酶处理它们来检索这些 DNA 序列。大肠杆菌还可以通过在液体培养基中培养细胞并将它们保存在摇床培养箱中来产生插入的 DNA 片段的多个拷贝。这会导致大肠杆菌细胞快速分裂,从而产生所需插入的 DNA 片段的多个拷贝。

在基于大肠杆菌的生物传感器中

污染现在已成为全球关注的主要问题。我们需要像生物传感器这样的新设备,它可以轻松检测环境中有害污染物的存在。生物传感器是使用生物成分来检测周围任何物理化学变化的设备。这些设备由两个组件组成,生物和传感器或检测器。生物成分可以是任何生物元素,如细胞、生物体、组织等。换能器将分析物与生物成分相互作用产生的信号转换成物理化学信号(电化学、压电信号)。研究人员制造了大肠杆菌生物传感器来检测 3-苯氧基苯甲酸 (3-PBA) 的存在。3-PBA 是拟除虫菊酯类杀虫剂的主要代谢物。拟除虫菊酯是神经毒素,可导致人类严重疾病,如皮肤刺激、恶心、免疫系统抑制,长期接触拟除虫菊酯可能导致癌症。使用全细胞生物传感器可以很容易地检测到尿液和血浆中 3-PBA 的存在。它基于竞争性 ELISA,由在其表面显示抗 -3-PBA 抗体的整个大肠杆菌细胞组成。当这些工程大肠杆菌细胞与 3-PBA 蛋白偶联物混合时,会发生交联,这很容易在视觉上检测到。当将含有游离 3-PBA 的样品添加到该混合物中时,它会与交联竞争,从而导致产量发生变化。因此,可以很容易地检测到人体尿液或血浆样本中是否存在 3-PBA。长期接触拟除虫菊酯可能会导致癌症。使用全细胞生物传感器可以很容易地检测到尿液和血浆中 3-PBA 的存在。它基于竞争性 ELISA,由在其表面显示抗 -3-PBA 抗体的整个大肠杆菌细胞组成。当这些工程大肠杆菌细胞与 3-PBA 蛋白偶联物混合时,会发生交联,这很容易在视觉上检测到。当将含有游离 3-PBA 的样品添加到该混合物中时,它会与交联竞争,从而导致产量发生变化。因此,可以很容易地检测到人体尿液或血浆样本中是否存在 3-PBA。长期接触拟除虫菊酯可能会导致癌症。使用全细胞生物传感器可以很容易地检测到尿液和血浆中 3-PBA 的存在。它基于竞争性 ELISA,由在其表面显示抗 -3-PBA 抗体的整个大肠杆菌细胞组成。当这些工程大肠杆菌细胞与 3-PBA 蛋白偶联物混合时,会发生交联,这很容易在视觉上检测到。当将含有游离 3-PBA 的样品添加到该混合物中时,它会与交联竞争,从而导致产量发生变化。因此,可以很容易地检测到人体尿液或血浆样本中是否存在 3-PBA。大肠杆菌细胞在其表面显示抗-3-PBA抗体。当这些工程大肠杆菌细胞与 3-PBA 蛋白偶联物混合时,会发生交联,这很容易在视觉上检测到。当将含有游离 3-PBA 的样品添加到该混合物中时,它会与交联竞争,从而导致产量发生变化。因此,可以很容易地检测到人体尿液或血浆样本中是否存在 3-PBA。大肠杆菌细胞在其表面显示抗-3-PBA抗体。当这些工程大肠杆菌细胞与 3-PBA 蛋白偶联物混合时,会发生交联,这很容易在视觉上检测到。当将含有游离 3-PBA 的样品添加到该混合物中时,它会与交联竞争,从而导致产量发生变化。因此,可以很容易地检测到人体尿液或血浆样本中是否存在 3-PBA。


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